内切酶是从细菌中分离出来的一种能在特异位点切割DNA分子的核酸内切酶，目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序，这一顺序大多为具有一对称中心的回文序列，如从大肠杆菌中分离的EcoR I识别：…GAATTC…切割后产生
…CTTAAG…
…G和AATTC…的末端
…CTTAA G…
该末端由于有一段小的能互补配对的单链突出，故称为粘性末端。切割后的末端为3’-OH和5’-磷酸基团。即…G-OH
…CTTAA-P。
有的限制性酶识别四碱基对的顺序，如San3A识别GATC；有的识别六碱基对，如上述的ECOR I。识别四碱基对的内切酶由于识别顺序在DNA出现的频率更高（四碱基酶为44=256，六碱基酶为46＝4096），因而可将DNA切割成更小的片段，而识别八碱基对的Not I
…GCGGCCGC…
…CGCCGGCG…。
则识别和切割位点更少（48＝65536），但碱基并不以均等的概率出现，因而切割后产生的片段变化范围很大。
限制性内切酶作用的温度一般为37℃，反应体系中以Mg2＋为单独的辅助因子，且要求pH缓冲在7.5左右。
商品酶都保存在50％的甘油溶液中，-20℃贮存，活性通常较高，5u/μl（每单位即最适条件下1小时内*酶解1μg DNA的酶量）。
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